Пи-Си-Ар метода

Пи-Си-Ар (енгл. polymerase chain reaction) или реакција ланчане полимеризације је метод у молекуларној генетици који омогућава селективно умножавање одређног сегмента молекула ДНК. Пи-Си-Ар метода се заснива на принципима репликације ДНК. Да би се извршило умножавање одабраног региона ДНК, неопходо је да познајемо структуру његових граничних региона. На основу тих података конструишу се једноланчани низови од око 20 нуклеотида — тзв. прајмери, који су комплементарни овим регионима. У Пи-Си-Ар реакцији прајмери се везују за матричне нити ДНК и служе ДНК полимерази као прајмери за синтезу нових ланаца нуклеотида.

У једном цилкусу умножавања могу се издвојити три основне фазе:

  1. денатурација ДНК,
  2. комплементарно повезивање прајмера за једноланчане матрице, и
  3. синтеза нових ланаца.

Свака фаза Пи-Си-Ар реакције је одређна температуром на којој се одвија и временом трајања. Циклуси умножавања се понављају 25-40 пута, и на тај начин се експоненцијално увећава број копија одабраног сегмента ДНК.

Кључни корак у развоју методе означила је изолација термостабилне ДНК полимеразе, која може да сачува ефикасност током цикличних температурних промена. Такав ензим добијен је из термофилног бактеријског соја Thermus aquaticus, и познат је као Taq полимераза.

У класичној реакционој смеши за Пи-Си-Ар налазе се: ДНК која се анализира, специфични прајмери, ензим Taq полимераза, слободни нуклеотиди за синтезу нових ланаца (у виду дНТП), јони Mg++ и одговарајући пуфер. За извођње Пи-Си-Ар реакције користе се аутоматизовани апарати, у којима се према задатом програму смењују температуре појединих фаза. На почетку сваког циклуса врши се денатурација узорка ДНК на температури од 94-960 °C. Удругој фази — фази аннеалинг-а или хибридизације, пар прајмера се специфично везује за комплементарне регионе ДНК, ограничавајуци сегмент који треба да буде амплификован. Повезивање прајмера се одвија на температури која зависи од њихове секвенце тј. редоследа нуклеотида, а износи 50-700 °C. Трећа фаза је фаза синтезе ДНК, позната и као фаза екстензије. Ензим Taq ДНК полимераза врши синтезу нових (комплементарних) ланаца нуклеотида, који се настављају на прајмере у 5’-3’ смеру. Таq полимераза остварује оптимално дејство на 720 °C, па је то уобичајена температура на којој се одвија фаза екстензије; време трајања је одређено величином региона који се умножава. На завршетку ове фазе добијају се две копије сегмента ДНК који је ограничен прајмерима. Реакција се затим циклично понавља а у сваком новом циклусу као матрице служе и новосинтетисани молекули ДНК. Након 25-40 циклуса жељени сегмент ДНК је умножен 104 — 106 пута, што омогућава његово уочавање после гел-електрофорезе и бојења.

ИзвориУреди