Ензимска кинетика — разлика између измена
Садржај обрисан Садржај додат
Нема описа измене |
м . using AWB |
||
Ред 29:
При овим мерењима се користи и појава промене у [[fluorescencija|флуоресценцији]] коензима или флуоресцентних боја (додају се на одређено место на [[протеин]]у) кроз механизам, што омогућава праћење покрета на активном месту протеина.<ref>{{en}}-{Xie XS, Lu HP. [http://www.jbc.org/cgi/content/full/274/23/15967 ''Single-molecule enzymology.''] J Biol Chem. 1999 Jun 4;274(23):15967-70. PMID 10347141}-</ref>
На овај начин стиче се нова представа о кинетици и динамици појединачних молекула за разлику од класичне ензимске кинетике, која посматра понашање великог броја молекула ензима као целине.<ref>{{cite journal |last=H|first=Lu|title=Single-molecule spectroscopy studies of conformational change dynamics in enzymatic reactions |journal=Current pharmaceutical biotechnology |volume=5 |issue=3 |year=2004|pmid=15180547|pages=261-9}}</ref><ref>{{cite journal |
На графику реакционе криве је приказан уобичајен ток кинетичке криве при настајању продукта, који се користи при изучавању ензима. На почетку реакције продукт се формира [[линеарна једначина|линерном]] почетном брзином, како реакција тече брзина се смањује због утрошка супстрата или нагомилавања продукта што се на кинетичкој кривој види као одступање од линеарности. Дужина линеарног дела зависи од радних услова, а може се кретати од милисекунде до сата. Обично се услови подешавају тако да област графика где је брзина линеарна траје више од минута чиме се олакшава рад.
Ред 60:
[\mbox{E}]_{tot} \ \stackrel{\mathrm{def}}{=}\ [\mbox{E}] + [\mbox{ES}]
</math>
што је приближно једнако концентрацији -{ES}- при сатурацији.
[[Михаелис-Ментенина кинетика|Михаелис-Ментенина једначина]]<ref>{{en}}-{Michaelis L. and Menten M.L. ''Kinetik der Invertinwirkung'' Biochem. Z. 1913; 49:333–369 [http://web.lemoyne.edu/~giunta/menten.html English translation] Accessed 6 April}- 2007</ref> описује зависност брзине реакције од положаја равнотеже при везивању супстрата за ензим и константе брзине -{''k''<sub>2</sub>}-. [[Леонор Михаелис]] и [[Мод Ментен]] су показали да се у случају да је -{''k''<sub>2</sub>}- много мање од -{''k''<sub>-1</sub>}- може извести следећа једначина:
Ред 96:
v = k_{2} [\mathrm{ES}] = \frac{k_{2}}{K_{m}} [\mbox{E}] [\mbox{S}]
</math>
где је [Е] концентрација слободног ензима. Стога, специфична константа је заправо константа брзине за бимолекуларну реакцију слободног ензима и слободног супстрата када настаје продукт. Специфична константа зависи од учесталости реакција ензима и супстрата у раствору а вредности јој се крећу око -{10<sup>10</sup> M<sup>
=== Линеарна зависност Михаелис-Ментен једначине ===
Ред 104:
График зависности -{1/v}- од 1/-{[S]}- је линеаран. Иако је на почетку, при ниским концентрацијама супстрата линеаран, при високим вредностима -{[S]}- када долази до сатурације права линија постаје крива. Нелинеарност је представљала проблем при одређивању -{''K''<sub>m</sub>}- и -{''V''<sub>max</sub>}- пре него што је почела употреба нелинеарног фитовања кривих. Због тога је неколико научника развило линеаризацију Михаелис-Ментенине једначине путем [[Лајнвивер-Бурков график|Лајнвивер-Бурковог графика]], [[Еди-Хофстеов дијаграм|Еди-Хофстеовог дијаграма]] и [[Ханес-Вулфов график|Ханес-Вулфовог графика]].
Лајнвивер-Бурков график или двоструко реципрочан график је уобичајен начин приказивања кинетичких података и користи реципрочне вредности брзине реакције и концентрације супстрата. Као што се може уочити, график зависности
:<math>\frac{1}{v} = \frac{K_{m}}{V_{max} [\mbox{S}]} + \frac{1}{V_{max}}</math>
Ред 158:
Мерења кинетике датих реакција спроведена под различитим условима или са незнатно модификованим ензимима или супстратима могу често дати увид у хемијски механизам, зато што одређују најспорији ступањ или интермедијере у реакцији. На пример, раскидање [[ковалентна веза|ковалентне везе]] између [[водоник]]овог атома и остатка молекула је често одлучујући ступањ реакције. Заменом једног по једног водониковог атома [[деутеријум]]има и праћењем брзине реакције замене може се одредити који тачно водоников атом учествује у најспоријем ступњу. Брзина ће се променити када водоник који учествује у одлучујућем ступњу буде замењен, због примарних [[кинетички изотопски ефекат|кинетичких изотопских ефеката]] који се дешавају зато што је везе са деутеријумом много теже раскинути него везе са водоником.<ref>{{en}}-{Cleland WW. [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WB5-4DD8DXJ-8&_coverDate=01%2F01%2F2005&_alid=466049795&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=6701&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=cf322c4a1c7db6b9f89551a8469a1a2d ''The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms.''] Arch Biochem Biophys. 2005 Jan 1;433(1):2–12. PMID 15581561}-</ref> Такође је могуће мерити сличне ефекте код других изотопских супституција, као што су -{<sup>13</sup>C/<sup>12</sup>C}- и -{<sup>18</sup>O/<sup>16</sup>O}-, али ови ефекти су много мање изражени.<ref>{{cite journal |last=D|first=Northrop|title=The expression of isotope effects on enzyme-catalyzed reactions |journal=Annu. Rev. Biochem. |volume=50 |issue= |year=1981|pmid=7023356|pages=103-31}}</ref>
Изотопски ефекти још могу бити искоришћени да објасне различите етапе прелаза молекула супстрата у финалне производе. На пример, понекад је веома тешко утврдити порекло атома [[кисеоник]]а у финалном производу; будући да могу потицати из воде или из дела супстрата. То може бити одређено систематском заменом стабилног изотопа кисеоника <sup>18</sup>O неким од молекула који учествују у реакцији, а затим се проверава присутност изотопа у производу.<ref>{{cite journal |
== Инхибиција ензима ==
Ред 167:
=== Реверзибилни инхибитори ===
Врсте реверзибилних инхибиција су: компетитивне, некомпетитивне, без инхибиције и мешовите, што зависи од дејства инхибитора на -{''K''<sub>m</sub>}- и -{''V''<sub>max</sub>}-.
Ови различити ефекти су последица везивања инхибитора за ензим -{Е}-, за комплекс ензим-супстрат -{ES}-, или за оба. Испитивањем кинетике ензима у функцији концентрације инхибитора можемо закључити о ком се типу инхибитора ради. Наиме, уколико ову зависност приказемо путем Лајнвивер-Бурковог и Еди-Хофстеовог графика<ref name=autogenerated1 />, можемо видети да се у случају сва четри типа инхибиције промена кинетике ензима врши на себи својствен начин. Једноставности ради, у употреби су два симбола:
:<math> \alpha = 1 + \frac{[\mbox{I}]}{K_{i}} </math> и <math>\alpha^{\prime} = 1 + \frac{[\mbox{I}]}{K_{i}^{\prime}}</math>
Ред 213:
[[Датотека:Activation2 updated sr.svg|мини|300п|Промена енергије са реакционом координатом показује стабилизацију стања неког ензима.]]
{{main|Ензимска катализа}}
Најчешће коришћен модел за интеракцију ензима и супстрата је индуковани фит модел.<ref>{{en}}-{Koshland DE, [http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=335371&blobtype=pdf ''Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis.''}-] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1958 Feb;44(2):98–104. PMID 16590179</ref> По овом моделу почетна интеракција између ензима и супстрата је релативно слаба, али ова слаба интеракција брзо изазива конформационе промене ензима које омогућавају јаче везивање супстрата. Ове промене такође доводе каталитичке остатке на активна места у близини хемијске везе у супстрату, које ће бити промењене у реакцији.<ref>{{cite journal |last=G|first=Hammes|title=Multiple conformational changes in enzyme catalysis |journal=Biochemistry |volume=41 |issue=26 |year=2002|pmid=12081470|pages=8221–8}}</ref> Пошто се заврши везивање, један или више механизма катализе снижавају енергију [[прелазно стање|прелазног стања]], омогућавајући алтернативни пут реакције. Механизми катализе подразумевају катализу путем: деформације везе, приближавања и оријентације, путем протон-донора или протон-акцептора активних места, ковалентном катализом и квантним тунеловањем.<ref name=Fersht/><ref>{{cite journal |
Ензимска кинетика не може да покаже који је мод катализе коришћен од стране ензима. Ипак, неки кинетички подаци могу да предвиде могућности које могу бити испитиване другим техникама. На пример, пинг-понг механизам указује да би [[ковалентна катализа]] могла бити важна за ензимски механизам. Такође, уочен јак ефекат -{pH}- на -{''V''<sub>max</sub>}- али не на -{''K''<sub>m</sub>}- може да указује на то да остатак на активном месту мора да буде у одређеном [[јонизација|јонизационом]] стању да би се каталитички процес одиграо.
| |||