Циркуларни дихроизам — разлика између измена

'''Циркуларни дихроизам (ЦД)''' заснива се на различитој апсорпцији десно и лево кружно поларизоване [[светлост]]и која је последица структурне асиметрије.<ref name="Fasman">{{Cite book |author=Fasman, G.D. |title=Circular dichroism and Conformational Analysis of Biomolecules |year=1996 |publisher=Plenum press |location=New York}}</ref> Уређене структуре имају ЦД сигнале док неуређене немају. ЦД [[спектроскоп]]ија је метода која се користи за утврђивање [[Стереоизомерија|оптичке изомерије]] [[молекул]]а, а и за одређивање [[Sekundarnaсекундарна strukturaструктура proteinaпротеина|секундарне]] и [[Терцијарна структура протеина|терцијарне структуре]] [[протеин]]а<ref name="Практикум1_2007">{{Cite book |author=А. Поповић-Бијелић, М. Мојовић |title=Практикум из биофизичке хемије |publisher=Универзитет у Београду- Факултет за физичку хемију |issue=1. |year=2007 |location=Београд}}</ref>.

моларни циркуларни дихроизам. На ову величину се најчешће мисли под појмом циркуларни дихроизам супстанце. Иако се често мери -{ΔА}-, уобичајено је да се ексцентрицитет елиптично поларизоване светлости изрази величином која се зове [[елиптицитет]] (θ), θ = -{[[аркус тангенс|arctan]]}- (-{а/b}-). Да би било могуће поређење елиптицитета за узорке различитих концентрација потребно је изразити елиптицитет по јединици концентрације, или по броју резидуа. Зато се уводи нова величина - моларни елиптицитет [θ].<ref>{{cite web |url=http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/course/section8/ss-960531_21.html |title=Circular dichroism spectroscopy}}</ref>

Скоро сви биолошки молекули су оптички активни. Како се ЦД примењује на апсорпционе траке било ког оптички активног молекула, он ће бити примењен за биолошке молекуле, због десне ротације (нпр. неки [[шећер]]и) и леве ротације (нпр. неке [[аминокиселина|аминокиселине]]) коју они поседују. Такође можемо одредити [[секундарна структура proteina|секундарну структуру]] посматрањем ЦД за дати молекул. Дакле, [[алфа хеликс]] [[протеин]]а и дупли (дволанчани) хеликс нуклеинских киселина имају карактеристичне ЦД спектре за своје структуре.

ЦД спектар непознатог протеина = -{f_αS_α(λ) + f_βS_β(λ) + f_RCS_RC(λ)}-, где су -{S_α(λ), S_β(λ)}-, и -{S_RC(λ)}- изведене из основног спектра поли-Л-лизина. Недостатак ове методе је то што иако је лако добити вредности за -{S_α(λ), S_β(λ)}-, и -{S_RC(λ)}- из директних мерења, оне нису увек усаглашене од једне лабораторије до друге. Такође, мора се узети у обзир и дужина ланца и утицај [[агрегатноагрегатна стањестања|агрегатног стања]] овог скупа база спектра. Међутим, овај метод је обично тачан до 10% за садржај [[Алфа хеликс|α-хеликса]].

За одређивање [[секундарна структура proteina|секундарне структуре]], посматрају се спектри у далекој -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области (190-250 -{nm}-) и уколико је протеин у нативној (савијеној) конформацији – пептидна веза ће давати ЦД сигнал.

За одређивање [[Терцијарна структура протеина|терцијарне структуре]], посматрају се ЦД спектри у блиској -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области (250-350 -{nm}-) и уколико је протеин у нативној конформацији, ЦД сигнали ће потицати од ароматичних аминокиселина и [[дисулфидни мост|дисулфидних мостова]]. Сигнали у области од 250-270 -{nm}- потичу од фенилаланина, од 270-290 -{nm}- од тирозина и од 280-300 -{nm}- од [[триптофан]]а. [[Дисулфидна веза|Дисулфидне везе]] дају широке, слабе сигнале у целој блиској -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области. Уколико не постоји никакав сигнал у области од 250-350 -{nm}-, значи да се протеин не налази у нативној конформацији.<ref name="Практикум1_2007" />.

ЦД даје мање специфичну информацију о структури од нпр. рендгено-структурне анализе или [[Нуклеарна магнетна резонанција|НМР]] спектроскопије протеина, које дају податке о атомима. Међутим, ЦД спектроскопија је брза метода, која не захтева велике количине протеина, нити дугу обраду података. ЦД се може користити за испитивање услова растворљивости, промене температуре, -{[[pH вредност|pH]]}-, [[јонска јачина|јонске јачине]] и присуства различитих фактора.

ЦД може да се користи и за проучавање [[Угљениугљени хидратихидрат|угљених хидрата]], али са ограниченим успехом због тешкоћа повезаних са снимањем ЦД спектра у вакуум ултраљубичастој ([[UVултраљубичасто зрачење|-{VUV}-]]) области спектра (100-200 -{nm}-), где одговарајуће ЦД траке несупституисаних [[Угљениугљени хидратихидрат|угљених хидрата]] леже. Спектри супституисаних угљених хидрата са тракама изнад [[UVултраљубичасто зрачење|-{VUV}-]] области се успешно снимају .

Мерења ЦД-а такође су компликована због чињенице да водени јонски [[пуфер]]ски системи често апсорбују у области где структурне особине показују различиту апсорпцију кружно поларизоване светлости. При снимању ЦД спектара [[фосфат]]них, [[сулфат]]них, [[карбонат]]них и [[ацетат]]них [[јон]]а морају се користити веома разблажени раствори. [[Борати]] и [[амонијум соли]] се често користе за одређивање одговарајуће -{pH}- области за ЦД пробе. За повећање јонске јачине, неки експериментатори замењују хлоридни јон флуоридним, јер флуоридни јон апсорбује мање у далекој -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области, а неки раде у чистој води. Други начин да се минимизира апсорпција растварача је примена ужих ћелија, чиме се смањује пут светлости кроз испитивани узорак (обично када се ради у далекој -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области користе се ћелије ширина до 0,1 -{mm}- ).

ЦД спектри протеина коришћени за процену [[Sekundarnaсекундарна strukturaструктура proteinaпротеина|секундарне структуре]] повезани су са π - π* прелазима, који су последица апсорпције [[амидна веза|амидне везе]]. Ове апсорпционе траке леже делимично у вакуумској ултраљубичастој области (таласне дужине мање од 200 -{nm}-). Област ове таласне дужине је неприступачна због снажне апсорпције [[кисеоник]]а, тако да је снимање на инструментима ослобођеним од [[кисеоник]]а (пуњеним чистим гасом [[азот]]ом) неопходно.

Такође је потребно да се достигне адекватан однос [[сигнал-шум однос|сигнал-шум]] (-{S/N}- је пропорционално квадратном корену дела времена за које се снима спектар). Зато је потребно 30-60 мин. да се сниме спектри за одређивање [[Sekundarnaсекундарна strukturaструктура proteinaпротеина|секундарне структуре]] (плус исти део времена за базну линију за сваки ЦД спектрометар).

Уобичајен извор светлости у овим инструментима је кратко-лучна [[ксенонска лампа]] под високим притиском. Обичне ксенонске лучне лампе су неприкладне за употребу у далекој -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области. Уместо специјално саграђених лампи са омотима направљеним од синтетике високе чистоће, растопљени [[силикати]] морају бити употребљени. Светлост са извора синхротрона има много већи флукс на краћим таласним дужинама и коришћена је за ЦД испод 160 -{nm}-.