Ензимска кинетика — разлика између измена

Садржај обрисан Садржај додат
Autobot (разговор | доприноси)
м Бот: исправљена преусмерења
Autobot (разговор | доприноси)
м Разне исправке
Ред 23:
[[Датотека:Enzyme progress curve sr.svg|мини|лево|250п|Реакциона крива ензимски катализоване реакције. Почетни део криве је линеаран и одговара иницијалном ступњу реакције.]]
Изучавање ензима подразумева експерименте којима се одређују брзине ензимски каталисаних реакција. Како се ензим не троши у реакцији коју катализује, да би се одредила брзина реакције прате се промене концентрације како супстрата тако и продукта.
Постоји већи број метода за одређивање брзине. Спектрофотометријске методе прате промену апсорбанције светлости од стране реактаната односно продуката са временом и оне су врло практичне јер омогућавају континуално мерење брзине. Радиометријске методе прате уграђивање или ослобађање [[радиоактивност]]и у циљу мерења количине продукта награђене у току времена. Ради се о дисконтинуалним методама јер захтевају издвајање узорка а обично су врло осетљиве и омогућавају мерење веома ниске ензимске активности.<ref>{{Cite book|authorlast=Danson|first=Eisenthal R. Danson M.J. (Eds),|title=Enzyme Assays: A Practical Approach|url=|publisher=Oxford University Press|location=|year=2002|isbn=978-0-19-963820-8|pages=}}</ref>
Сличан приступ проблему има [[масена спектрометрија]] при праћењу уграђивања или ослобађања [[стабилни изотоп|стабилних изотопа]] у току преласка реактаната у продукте.
 
Ред 29:
 
При овим мерењима се користи и појава промене у [[fluorescencija|флуоресценцији]] коензима или флуоресцентних боја (додају се на одређено место на [[протеин]]у) кроз механизам, што омогућава праћење покрета на активном месту протеина.<ref>{{en}}-{Xie XS, Lu HP. [http://www.jbc.org/cgi/content/full/274/23/15967 ''Single-molecule enzymology.''] J Biol Chem. 1999 Jun 4;274(23):15967-70. PMID 10347141}-</ref>
На овај начин стиче се нова представа о кинетици и динамици појединачних молекула за разлику од класичне ензимске кинетике, која посматра понашање великог броја молекула ензима као целине.<ref>{{cite journal |authorlast=Lu H |first=Lu|title=Single-molecule spectroscopy studies of conformational change dynamics in enzymatic reactions |journal=Current pharmaceutical biotechnology |volume=5 |issue=3 |year=2004|pmid=15180547|pages=261-9}}</ref><ref>{{cite journal |author=Schnell J, Dyson H, Wright P |title=Structure, dynamics, and catalytic function of dihydrofolate reductase |journal=Annual review of biophysics and biomolecular structure |volume=33 |issue= |year=2004|pmid=15139807|pages=119-40}}</ref>
 
На графику реакционе криве је приказан уобичајен ток кинетичке криве при настајању продукта, који се користи при изучавању ензима. На почетку реакције продукт се формира [[линеарна једначина|линерном]] почетном брзином, како реакција тече брзина се смањује због утрошка супстрата или нагомилавања продукта што се на кинетичкој кривој види као одступање од линеарности. Дужина линеарног дела зависи од радних услова, а може се кретати од милисекунде до сата. Обично се услови подешавају тако да област графика где је брзина линеарна траје више од минута чиме се олакшава рад.
Ред 62:
што је приближно једнако концентрацији -{ES}- при сатурацији.
 
[[Михаелис-Ментенина кинетика|Михаелис-Ментенина једначина]]<ref>{{en}}-{Michaelis L. and Menten M.L. ''Kinetik der Invertinwirkung'' Biochem. Z. 1913; 49:333–369 [http://web.lemoyne.edu/~giunta/menten.html English translation] Accessed 6 April 2007}- 2007</ref> описује зависност брзине реакције од положаја равнотеже при везивању супстрата за ензим и константе брзине -{''k''<sub>2</sub>}-. [[Леонор Михаелис]] и [[Мод Ментен]] су показали да се у случају да је -{''k''<sub>2</sub>}- много мање од -{''k''<sub>-1</sub>}- може извести следећа једначина:
 
:<math> v = \frac{V_{max}[\mbox{S}]}{K_m + [\mbox{S}]} </math>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;''(Једначина 2)''
Ред 151:
Овакав прилаз је прво био примењен на реакције хидролизе каталисане хемотрипсином. Веома често, откриће неке интермедијерне врсте је пресудно у испитивању механизма ензимске реакције. На пример, у случају хемотрипсина<ref>{{en}}-{Hartley B.S. and Kilby B.A. [http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=1269615&blobtype=pdf ''The reaction of p-nitrophenyl esters with chymotrypsin and insulin.''] Biochem J. 1954 Feb;56(2):288-97. PMID 13140189}-</ref>, везивањем супстрата за [[нуклеофил]]ни серин који је део активног места ствара се ацил-ензим интермедијер.
 
Са графика зависности количине створених продуката од времена видимо да се у првих пар секунди реакције интермедијер -{Е}-*<ref name=Fersht>{{Cite book|authorlast=Alan Fersht|first=Alan|title=Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding|url=|publisher=W. H. Freeman|location=|year=1998|isbn=978-0-7167-3268-6|pages=}}</ref> ствара веома брзо, а затим се брзина смањује све до успостављања стационарног стања система. Ова брза кратка фаза реакције мери један каталитички циклус. Према томе, количина продуката ослобођена у овој фази и на графику приказана као пресек са ''-{y}-'' осом такође даје количину употребљивог ензима.<ref>{{en}}-{Bender ML, Begue-Canton ML, Blakeley RL, Brubacher LJ, Feder J, Gunter CR, Kezdy FJ, Killheffer JV Jr, Marshall TH, Miller CG, Roeske RW, Stoops JK. ''The Determination of the Concentration of Hydrolytic Enzyme Solutions : a-Chymotrypsin, Trypsin, Papain, Elastase, Subtilisin, and Acetylcholinesterase.'' J Am Chem Soc. 1966 Dec 20;88(24):5890-913. PMID 5980876}-</ref>
 
== Хемијски механизам ==
Један од важнијих циљева мерења кинетике ензимских процеса је одређивање хемијског механизма неке ензимске реакције тј. редослед хемијских ступњева који трансформису супстрат у производ. Кинетички процеси који су дати као пример у даљем тексту разматрају још и којом се брзином интермедијери стварају али не могу тачно дефинисати шта су ти интермедијери.
 
Мерења кинетике датих реакција спроведена под различитим условима или са незнатно модификованим ензимима или супстратима могу често дати увид у хемијски механизам, зато што одређују најспорији ступањ или интермедијере у реакцији. На пример, раскидање [[ковалентна веза|ковалентне везе]] између [[водоник]]овог атома и остатка молекула је често одлучујући ступањ реакције. Заменом једног по једног водониковог атома [[деутеријум]]има и праћењем брзине реакције замене може се одредити који тачно водоников атом учествује у најспоријем ступњу. Брзина ће се променити када водоник који учествује у одлучујућем ступњу буде замењен, због примарних [[кинетички изотопски ефекат|кинетичких изотопских ефеката]] који се дешавају зато што је везе са деутеријумом много теже раскинути него везе са водоником.<ref>{{en}}-{Cleland WW. [http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WB5-4DD8DXJ-8&_coverDate=01%2F01%2F2005&_alid=466049795&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=6701&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=cf322c4a1c7db6b9f89551a8469a1a2d ''The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms.''] Arch Biochem Biophys. 2005 Jan 1;433(1):2–12. PMID 15581561}-</ref> Такође је могуће мерити сличне ефекте код других изотопских супституција, као што су -{<sup>13</sup>C/<sup>12</sup>C}- и -{<sup>18</sup>O/<sup>16</sup>O}-, али ови ефекти су много мање изражени.<ref>{{cite journal |authorlast=Northrop D |first=Northrop|title=The expression of isotope effects on enzyme-catalyzed reactions |journal=Annu. Rev. Biochem. |volume=50 |issue= |year=1981|pmid=7023356|pages=103-31}}</ref>
 
Изотопски ефекти још могу бити искоришћени да објасне различите етапе прелаза молекула супстрата у финалне производе. На пример, понекад је веома тешко утврдити порекло атома [[кисеоник]]а у финалном производу; будући да могу потицати из воде или из дела супстрата. То може бити одређено систематском заменом стабилног изотопа кисеоника <sup>18</sup>O неким од молекула који учествују у реакцији, а затим се проверава присутност изотопа у производу.<ref>{{cite journal |author=Baillie T, Rettenmeier A |title=Drug biotransformation: mechanistic studies with stable isotopes |journal=Journal of clinical pharmacology |volume=26 |issue=6 |year=1986|pmid=3734135|pages=448-51}}</ref> Хемијски механизам такође може бити разјашњен испитивањем кинетичких и изотопских ефеката под различитим -{pH}- условима<ref>{{en}}-{Cleland WW. ''Use of isotope effects to elucidate enzyme mechanisms.'' CRC Crit Rev Biochem. 1982;13(4):385–428. PMID 6759038}-</ref>, заменом металних јона или других везаних коензима<ref>{{en}}-{Christianson DW, Cox JD. ''Catalysis by metal-activated hydroxide in zinc and manganese metalloenzymes.'' Annu Rev Biochem. 1999;68:33–57. PMID 10872443}-</ref>, [[просторно одређена мутагенеза|просторно одређеном мутагенезом]] очуваних остатака аминокиселине или испитивањем понашања ензима у присуству аналога супстрата.<ref>{{cite journal |author=Kraut D, Carroll K, Herschlag D |title=Challenges in enzyme mechanism and energetics |journal=Annu. Rev. Biochem. |volume=72 |issue= |year=2003|pmid=12704087|pages=517-71}}</ref>
Ред 213:
[[Датотека:Activation2 updated sr.svg|мини|300п|Промена енергије са реакционом координатом показује стабилизацију стања неког ензима.]]
{{main|Ензимска катализа}}
Најчешће коришћен модел за интеракцију ензима и супстрата је индуковани фит модел.<ref>{{en}}-{Koshland DE, [http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=335371&blobtype=pdf ''Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis.''}-] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1958 Feb;44(2):98–104. PMID 16590179</ref> По овом моделу почетна интеракција између ензима и супстрата је релативно слаба, али ова слаба интеракција брзо изазива конформационе промене ензима које омогућавају јаче везивање супстрата. Ове промене такође доводе каталитичке остатке на активна места у близини хемијске везе у супстрату, које ће бити промењене у реакцији.<ref>{{cite journal |authorlast=Hammes G |first=Hammes|title=Multiple conformational changes in enzyme catalysis |journal=Biochemistry |volume=41 |issue=26 |year=2002|pmid=12081470|pages=8221–8}}</ref> Пошто се заврши везивање, један или више механизма катализе снижавају енергију [[прелазно стање|прелазног стања]], омогућавајући алтернативни пут реакције. Механизми катализе подразумевају катализу путем: деформације везе, приближавања и оријентације, путем протон-донора или протон-акцептора активних места, ковалентном катализом и квантним тунеловањем.<ref name=Fersht/><ref>{{cite journal |author=Sutcliffe M, Scrutton N |title=A new conceptual framework for enzyme catalysis. Hydrogen tunnelling coupled to enzyme dynamics in flavoprotein and quinoprotein enzymes |url=http://content.febsjournal.org/cgi/content/full/269/13/3096 |journal=Eur. J. Biochem. |volume=269 |issue=13 |year=2002|pmid=12084049|pages=3096-102}}</ref>
 
Ензимска кинетика не може да покаже који је мод катализе коришћен од стране ензима. Ипак, неки кинетички подаци могу да предвиде могућности које могу бити испитиване другим техникама. На пример, пинг-понг механизам указује да би [[ковалентна катализа]] могла бити важна за ензимски механизам. Такође, уочен јак ефекат -{pH}- на -{''V''<sub>max</sub>}- али не на -{''K''<sub>m</sub>}- може да указује на то да остатак на активном месту мора да буде у одређеном [[јонизација|јонизационом]] стању да би се каталитички процес одиграо.
Ред 228:
== Литература ==
{{refbegin|2}}
* {{Cite book |authorref=Alan harv|last=Fersht|first=Alan|title=Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding|url=|publisher=W. H. Freeman|location=|year=1998|isbn=978-0-7167-3268-6|pages=}}
* {{Cite book |authorref= harv|last=Danson|first=Eisenthal R. Danson M.J. (Eds),|title=Enzyme Assays: A Practical Approach|url=|publisher=Oxford University Press|location=|year=2002|isbn=978-0-19-963820-8|pages=}}
* {{Cite book|author=Ebbing, D. D.|title=General chemistry|url=|publisher=Houghton Mifflin Co|edition=4th|location=|year=1993|isbn=978-0-395-63696-1|pages=}}
* {{Cite book |ref= harv|author=Athel Cornish-Bowden|title=Fundamentals of Enzyme Kinetics|year=2004|url= |publisher=Portland Press|location= |id=|pages=|edition=3rd}}
* {{Cite book |ref= harv|authorlast=Segel|first=Irwin H. Segel|title=Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems|year=1993|url= |publisher=Wiley-Interscience; New Ed edition|location= |id=|pages=}}
* {{Cite book |authorref=Alan harv|last=Fersht|first=Alan|title=Structure and Mechanism in Protein Science : A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding.|url=|publisher=W. H. Freeman|location=|year=1998|isbn=978-0-7167-3268-6|pages=}}
* Santiago Schnell, Philip K. Maini, ''A century of enzyme kinetics: Reliability of the K<sub>M</sub> and v<sub>max</sub> estimates'', Comments on Theoretical Biology '''8''', 169–187, 2004 DOI: [http://www.informatics.indiana.edu/schnell/papers/ctb8_169.pdf 10.1080/08948550390206768]
* {{Cite book |ref= harv|last=Walsh|first=Chris|title=Enzymatic Reaction Mechanisms|year=1979|url= |publisher=W. H. Freeman and Company|location= |id=|pages=}}
* {{Cite book |ref= harv|last1=Price|first1=Nicholas|last2=Stevens|first2=Lewis|title=Fundamentals of Enzymology|year=1999|url= |publisher=Oxford University Press|location= |isbn=978-0-19-850229-6|pages=}}
* {{Cite book |authorref=Tim harv|last=Bugg|first=Tim|title=An Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry|url=|publisher=Blackwell Publishing|location=|year=2004|isbn=978-1-4051-1452-3|pages=}}
{{refend}}