Електрофореза — разлика између измена
Садржај обрисан Садржај додат
м added Category:Електроаналитички методи using HotCat |
. |
||
Ред 1:
[[
[[Датотека:Retardation Force.svg|thumb|250px|Иллустрација успорене електрофорезе]]
[[Датотека:Gel electrophoresis 2.jpg|thumb|right|250px|Гел електрофореза]]
'''Електрофореза''' (from the Greek "Ηλεκτροφόρηση" meaning "to bear electrons") метод је који се између осталог користи у [[молекуларна биологија|молекуларној биологији]] како би се раздвојили фрагменти [[ДНК]] молекула и утврдили њихове величине према величинама фрагмената које су унапред познате. Електрофорезом се мери кретање [[Interface and colloid science|диспергованих честица]] у односу на флуид под утицајем просторно униформног [[electric field|електричног поља]].<ref>{{cite book |first=J. |last=Lyklema |title= Fundamentals of Interface and Colloid Science |volume=vol. 2 |page=3.208 |year=1995}}</ref><ref>{{cite book |first=R.J. |last=Hunter |title=Foundations of Colloid Science |publisher=Oxford University Press |year=1989}}</ref><ref>{{cite book |first=S.S. |last=Dukhin |author2=B.V. Derjaguin |title=Electrokinetic Phenomena |publisher=J. Willey and Sons |year=1974}}</ref><ref>{{cite book |first=W.B. |last=Russel |author2=D.A. Saville |author3=W.R. Schowalter |title=Colloidal Dispersions |publisher=Cambridge University Press |year=1989}}</ref><ref>{{cite book |first=H.R. |last=Kruyt |title=Colloid Science |publisher=Elsevier |volume=Volume 1, Irreversible systems |year=1952}}</ref><ref>{{cite book |first=A.S. |last=Dukhin |author2= P.J. Goetz |title=Ultrasound for characterizing colloids |publisher=Elsevier |year=2002}}</ref><ref>{{Cite journal|last=Anderson|first=J L|date=January 1989|title=Colloid Transport by Interfacial Forces|url=https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.fl.21.010189.000425|journal=Annual Review of Fluid Mechanics |language=en|volume=21 |issue=1|pages=61–99 |doi=10.1146/annurev.fl.21.010189.000425 |issn=0066-4189}}</ref> Електрофореза позитивно наелектрисаних честица ([[катјон]]а) се понекад назива '''катафореза''', док се електрофореза негативно наелектрисаних честица (анјона) понекад назива '''анафорезом'''.
== Увод ==
Електрофореза, како само име наговештава, ради на принципу електричног поља у којем се [[ДНК]] молекул креће кроз смешу, и краћи ДНК фрагменти се крећу много брже од дужих фрагмената, јер је краћим фрагментима лакше да се крећу кроз смешу. Протеини се такође могу раздвојити на овај начин на основу њиховог наелектрисања и величине. Смеше које се користе за прављење могу бити од различитог материјала, али до сада се најбоље показала смеша, тј. гел направљен од [[агар]]озе.
Брзина кретања фрагмената кроз гел зависи од више фактора. Концентрација агарозе је један од фактора. Што је концентрација виша, кретање фрагмената, поготово великих фрагмената, је тежа. Сам облик ДНК фрагмената који се креће такође има утицај на брзину. На пример ДНК молекул може бити линеарни, спирално увијен у круг или линеарни са мањим оштећењима. Сваки од ових облика има другачију брзину кретања, спирално увијени је најбржи, док је линеарни најспорији. Присуство [[етидијум
== Примена ==
Смер кретања честице зависи од поларности њеног набоја, а брзина кретања повећава се са бројем набоја и јачином електричнога поља, док опада са порастом величине честице. Електрофоретска анализа биолошких [[макромолекул]]а, као што су [[нуклеинске киселине]] и [[беланчевине]], изводи се на [[агар]]озним и [[Polyacrylamide|полиакриламид]]ним [[гел]]овима различите порозности, која се одређује према величини честица. Након бојења, [[имунологија|имунске]] реакције или радиоактивног обележавања, те фотографског снимања гела, добија се слика или графички приказ који се зове '''електрофорезограм'''.
У савременој пракси, електрофореза је рутински и незаменљиви метод анализе серумских и ткивних беланчевина, у одређивању чистоће припреме [[нуклеинске киселине|нуклеинских киселина]] и у секвенцизању [[нуклеотид]]а у нуклеинским киселинама. Једна од варијанти електрофорезе је '''изоелектрично фокусирање'''.<ref name="Volet-Volet">{{cite book|author=Voet D., Voet J. G.|year=1990|title=Biochemistry, 3rd Ed.|publisher= Wiley|isbn=978-0-471-19350-0}}</ref>
Електрофореза се изводи у условима који омогућавају природну конформацију [[макромолекул]]а након потпуне [[Денатурација (биохемија)|денатурације]]. Комбинацијом тих метода на истом гелу добија се '''дводимензионална електрофореза''', која, само на једном електрофоретограму, може открити више хиљада беланчевина или се могу регистровати оне које недостају.
== Теоретске основе ==
Суспендоване честице имају [[Surface charge|површински електрични набој]], који је под снажним утицајем површине адсорбоване врсте,<ref>
{{cite journal
| last1=Hanaor
| first1=D.A.H.
| last2=Michelazzi
| first2=M.
| last3=Leonelli
| first3=C.
| last4=Sorrell
| first4=C.C.
| title= The effects of carboxylic acids on the aqueous dispersion and electrophoretic deposition of ZrO<sub>2</sub>
| journal= Journal of the European Ceramic Society
| year=2012
| volume=32
| issue=1
| pages=235–244
| url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0955221911004171
| doi=10.1016/j.jeurceramsoc.2011.08.015}}</ref> на коју спољашње електрично поље усмерава [[електростатика|електростатичне]] [[Кулонова сила|Кулонове силе]]. Према теорији о двослојности, сви површински набоји течности су контролисани [[Double layer (surface science)|дифузним слојем]] јона, који има исто апсолутно пуњење, али је супротног предзнака у односу на површински набој. Електрично поље такође испољава силе на јоне у дифузном слоју, које имају супротни смер од оног на [[Surface charge|површински набој]]. Ова потоња сила заправо се не примењује на честице, него на [[јон]]е у дифузном слоју, који се налазе на одређеној удаљености од површине честица, а део се преноси све до површине честица, путем [[вискозност |вискозног]] [[стрес (физика) |стреса]]. Овај део силе се такође означава као '''снага електрофоретског заостајања'''.
Када се примењује електрично поље и када се анализирају наелектрисане честице у стабилном кретању кроз дифузни слој, укупна резултирајућа сила је нула:
:<math> F_{tot} = 0 = F_{el} + F_{f} + F_{ret}</math>
С обзиром на [[отпор (физика) |отпор]] за кретање честица због [[вискозност]]и дисперзанта, у случају ниског [[Рејнолдсов број|Рејнолдсовог броја]] и умерене снаге [[електрично поље|електричног поља]] -{''E''}-, [[Drift velocity|брзина дрифта]] диспергираних честицa -{''v''}- је једноставно пропорционална примењеном пољу, што електрофоретску [[Електрична мобилност |мобилност]] μ<sub>e</sub> дефинише као:
:<math>\mu_e = {v \over E}.</math>
Најпознатију и нашироко кориштену теорију електрофорезе развио је [[Marian Smoluchowski|Смолуховски]], [[1903]].<ref>{{cite journal |first=M. |last=von Smoluchowski |journal=Bull. Int. Acad. Sci. Cracovie |volume=184 |year=1903 |title=Contribution à la théorie de l'endosmose électrique et de quelques phénomènes corrélatifs}}</ref>
:<math>\mu_e = \frac{\varepsilon_r\varepsilon_0\zeta}{\eta}</math>,
где је -{ε<sub>r</sub>}- = [[диелектрична константа]] [[Interface and colloid science|медијума дисперзије]], ε<sub>0</sub> = [[Dielektrična konstanta vakuuma|диелектрична константа слободног простора]], -{(C² N<sup>−1</sup> m<sup>−2</sup>), η}- = [[Вискозност флуида|динамичка вискозност]] дисперзијског медијума (-{Pa s}-), и ζ = [[Зета потентиал|зета потенцијал]] (односно електрокинетички потенцијал клизајуће површине у двоструком слоју).
Теорија Смолуховског је врло моћна, јер важи за [[Interface and colloid science|дисперговане честице]] било којег облика, у било којој [[концентрација|концентрацији]]. Нажалост, она има ограничења ваљаности, јер, на пример, чињеница је да не укључује [[Debye length|Дебајеву дужину]] κ<sup>-1</sup>. Међутим, Дебајева дужина мора бити важна за електрофорезу, као што се види на приложеној слици. Повећање дебљине двоструког слоја (ДЛ) доводи до уклањања тачке заостајања снаге даље од површине честице. Када је ДЛ дебљи, мора бити мања сила ретардације. Детаљна теоријска анализа показала је да је теорија Смолуховског важећа само за довољно танке двоструке слојеве, када је радијус честица -{''a''}- много већи од Дебајеве дужине:
:<math> a \kappa \gg 1</math>.
Овај модел „танког двоструког слоја” нуди огромне могућности поједностављења, не само за теорију електрофорезе, већ и за многе друге електрокинетичке теорије. Овај модел је важећи за већину [[вода|водених]] система, где је Дебајева дужина обично само неколико [[нанометар]]а. То не вреди само за наноколоиде у раствору са [[Ionic strength|јонском јачином]] близу водене.
Теорија Смолуховског такође занемарује допринос [[Surface conductivity|површинске проводљивости]]. У модерној теорији то се испољава као услов малог [[Dukhin number|Духиновог броја]]:
:<math> Du \ll 1 </math>
У настојању да се прошири опсег важења електрофоретске теорије, узет је у обзир супротни асимптотски случај, када је Дебајева дужина већа од радијуса честице:
:<math> a \kappa < \!\, 1</math>.
У овим околностима „дебелог двоструког слоја”, [[Erich Hückel|Хикел]]<ref>{{cite journal |first=E. |last=Hückel |year=1924|title=Die kataphorese der kugel|journal=Physik. Z. |volume=25 |page=204}}</ref> предвиђа следеће везе за електрофоретску мобилност:
:<math>\mu_e = \frac{2\varepsilon_r\varepsilon_0\zeta}{3\eta}</math>.
Овај модел је употребљив за неке наночестице и неполарне течности, где је Дебајева дужина много већа него у уобичајеним случајевима.
Постоји неколико аналитичких теорија које укључују [[површинска проводљивост|површинску проводљивост]] и елиминишу ограничења малог Духиног броја, а пионири су били Овербик<ref>{{cite journal |first=J.Th.G |last=Overbeek |journal=Koll. Bith. |page=287 |title=Theory of electrophoresis — The relaxation effect|year=1943}}</ref> и Бут.<ref>{{cite journal |first=F. |last=Booth |journal=Nature |volume=161 |issue=4081 |pages=83–6 |year=1948|bibcode = 1948Natur.161...83B |doi = 10.1038/161083a0 |pmid=18898334|title=Theory of Electrokinetic Effects }}</ref> Модерне, ригорозне теорије вреде за било који [[зета потенцијал]] и често било који -{''аκ''}- произлазе углавном из Духин-Семенихинове теорије.<ref>R. E. Offord: ''Electrophoretic mobilities of peptides on paper and their use in the determination of amide groups.'' In: ''Nature.'' Band 211, Nummer 5049, August 1966, S. 591–593, PMID 5968723.</ref>
У ограничењу ''танког двоструког слоја'', ове теорије потврђују нумеричко решење проблема О’Брајена i Вајта.<ref>{{cite journal |first=R.W. |last=O'Brien |author2=L.R. White |title=Electrophoretic mobility of a spherical colloidal particle|journal=J. Chem. Soc. Faraday Trans. |volume=2 |issue=74 |page=1607 |year=1978|doi=10.1039/F29787401607 }}</ref>
== Материјал ==
Линија 35 ⟶ 96:
== Резултат ==
Као крајњи продукт имамо гел са раздвојеним фрагментима, као што је на слици лево. У првој и последњој колони можемо да видимо мердевине које садрже различите величине и помоћу којих можемо да упоредимо фрагменте у средини. Боја бромофенол плава је успела да се надовеже на ДНК фрагменте и помоћу ово боје је уопште и могуће сада видети фрагменте и колико далеко су се кретали од џепова.
== Види још ==
{{colbegin|4}}
* [[Афинитетна електрофореза]]
* [[Капиларна електрофореза]]
* [[Диелектрофореза]]
* [[Гел-електрофореза]]
* [[Имуноелектрофореза]]
* [[Изоелектрично фокусирање]]
* [[Изотахофореза]]
* [[Електрофореза пулсирајућег поља]]
{{colend}}
== Референце ==
{{Reflist}}
== Литература ==
Линија 45 ⟶ 121:
* {{cite journal |first=J. |last=Shim |author2=P. Dutta |author3= C.F. Ivory |year=2007 |title=Modeling and simulation of IEF in 2-D microgeometries |journal=Electrophoresis |volume=28 |pages=527-586}}
{{refend}}
== Спољашње везе ==
{{Commons|Electrophoresis}}
* -{[http://web.med.unsw.edu.au/phbsoft/mobility_listings.htm List of relative mobilities]}-
{{Authority control}}
[[Категорија:Методи у молекуларној биологији]]
| |||