Рендгенска кристалографија — разлика између измена
Садржај обрисан Садржај додат
м Bot: Migrating 23 interwiki links, now provided by Wikidata on d:q826582 (translate me) |
м Разне исправке; козметичке измене |
||
Ред 1:
[[
'''Рендгенска структурна анализа''' (РСА) је техника за испитивање кристалних [[Хемијска супстанца|супстанци]], која користи дифракциону слику (дифрактограм) добијену расејавањем [[Рендгенско зрачење|рендгенског зрачења]] (''-{X-зрачења}-'') на испитиваном [[кристал]]у. Основни циљ РСА је одређивање кристалне и [[молекул]]ске структуре (дужине веза између атома, углови међу везама, апсолутне [[Конформациона изомерија|конформације]]...) испитиваног узорка.
Ред 10:
[[Рендгенско зрачење|Рендгенски зраци]] откривени су [[1895]]. године, и име су добили према свом проналазачу, немачком научнику [[Вилхелм Конрад Рентген|Вилхелму Конраду Рентгену]]. Прве експерименте са дифракцијом -{X}- зрачења на кристалима спровео је [[Макс фон Лауе]] [[1911]]. на кристалима [[со]]ли. Одмах је уочен огроман потенцијал ове методе за одређивање структуре молекула — до тада доступне само преко хемијских и [[Хидродинамика|хидродинамичких]] експеримената. Пионири у развоју рендгенске структурне анализе били су и [[Вилијам Браг]] и Бернал. Први [[протеин]] чија кристална структура је решена био је [[миоглобин]] једне врсте [[кит]]ова и то радовима [[Макс Перуц|Макса Перуца]] и [[Џон Каудери Кендру|Џона Кендрјуа]] ([[1958]]), за шта су добили [[Нобелова награда за хемију|Нобелову награду за хемију]].
[[
Данас је примена РСА у структурној биологији веома распрострањена — према подацима [[Протеинска банка података|Протеинске банке података]] ({{јез-енг|Protein Data Bank ,PDB}}) од око 42.000 [[протеин]]а чија структура је решена, за око 36.000 је заслужна рендгенска структурна анализа ([[НМР]] је допринела са око 6.000 решених структура, затим следе [[електронска микроскопија]], -{IC}- спектроскопија...).
== Теоријске основе ==
Основни услов који треба испунити да би дошло до [[Дифракција|дифракције]] електромагнетног зрачења јесте да таласна дужина зрачења и димензије решетке буду блиске. То је задовољено јер је таласна дужина -{X}--зрачења 10<sup>-9</sup>-10<sup>-11</sup> -{m}-, што је истог реда величине као и размак суседних равни у кристалу (1-10 Ǻ).
Ред 24:
=== Брагов закон ===
{{главни чланак|Брагов закон}}
[[
Према Браговом тумачењу, дифракција је еквивалентна рефлексији са система паралелних равни у кристалу. Нека монохроматско зрачење пада на кристал (слика испод). Делом се рефлектује са прве равни, а делом са друге.
Ред 36:
где је
* -{n}- – цео број, ред дифракције
* -{d}- – међураванско растојање
* θ – угао који упадно зрачење заклапа са кристалом
Овај закон намеће тачно одређене услове за θ и λ да би дошло до дифракције рендгенских зрака. Различитим експерименталним техникама ове две величине варирају се на различите начине и тако се стварају услови за појаву дифракције на кристалу. Интензитети дифракционих максимума зависе од врсте атома у кристалној решетки и од њиховог међусобног просторног распореда у складу са захтевима симетрије, тј. зависе од кристалне структуре супстанције.
Ред 50:
Стога су кристалне структуре неопходне за x-дифракциона испитивања, јер неуређена структура води томе да у свим тачкама простора добијемо исти интензитет расутог зрачења, што нам не даје никакву информацију о датој структури.
== Експерименталне методе РСА-е ==
=== Принцип извођења РСА-е ===
[[
На узорак (монокристал испитиваног једињења) се усмерава сноп x зрачења. У кристалографији се користе рендгенски зраци таласне дужине око 1 Ǻ добијени помоћу рендгенске цеви. Већина метода рендгенске структурне анализе захтева да зрачење буде што ближе монохроматском. У ту сврху испред или иза узорка на пут рендгенског зрачења се поставља монохроматор (кристал кварца, графита..) или код старијих инструмената филтри од танке металне фолије.
Ред 62:
Ако се одреде и интензитети зрачења и фазне разлике у односу на упадно зрачење може се, Фуријеовом трансформацијом, како је ниже објашњено, одредити просторна дистрибуција електронских густина:
ρ (x,y,z)= ΣhΣkΣl
Позната [[хемијска структура]] молекула који сачињава кристал омогућава да из мапе електронске густине добијемо модел кристала са одређеним положајем сваког атома, функционалне групе, структуре, у њему.
Ред 68:
Испод је дат преглед метода РСА-е и најзначајније примене.
=== Класификација експерименталних метода ===
Зависно од врсте узорка и избора експерименталне технике постоје различите методе рендгенске структурне анализе које су приказане у табели 1.
Ред 104:
Методе којима се испитују монокристали примењују се за одређивање симетрије, просторне групе кристала и за израчунавање параметара решетке. Њихова најзначајнија примена је речавање кристалне структуре једињења.
== Одређивање структуре монокристала ==
Велика примена РСА данас је, као што је већ поменуто, у одређивању структуре протеина и других биомолекула. Овде су описани основни кораци у једној таквој анализи [[протеина]]. Примењује се метод дифракције на монокристалу, и као што је горе поменуто користи се монохроматско рендгенско зрачење. Користи се монокристал испитиваног једињења.
=== Услови кристализације ===
Стварање кристала довољно квалитетног за дифракцију (довољно правилна структура) је један од главних проблема у експериментима одређивања атомске структуре протеина. До сада је овај процес слабо разјашњен и добијање доброг кристала своди се више на уметност него на науку. Основна идеја је споро, постепено смањење растворљивости молекула, било снижавањем температуре или повећавањем концентрације раствора. Ако се процес изведе брзо или са неравномерном променом ових величина тј. услова кристализације молекули само преципитују формирајући прах на дну суда.
Процес кристализације састоји се од два ступња: нуклеација (формирање клице) и кристални раст. Услови који одговарају нуклеацији нису увек исти као и они који погодују расту кристала, а у сваком случају је тешко претпоставити оптималне услове за оба. Зато се практично кристализација изводи тако што се припреми велики број раствора испитиваног молекула и затим испробавају различити услови- није ретко да се испробају стотине, чак и хиљаде услова да би дошло до кристализације на одговарајући начин. У услове које варирамо спадају
Традиционалне методе кристализације неорганских једињења модификоване су у циљу примене на протеине, који су термолабилни и осетљиви на високе концентрације органских растварача. Концентровани раствор протеина меша се са различитим растворима који се углавном састоје од:
* Пуфера, због контролисања -{pH}-
* Преципитациони агенс, који изазива пресићеност (обично полиетилен гликоли, соли као што су [[амонијум сулфат]] или органски алкохоли)
* Друге соли или адитиви, као што су [[детерџент]]и или [[кофактор]]и
Раствор протеина се затим концентрује. Постоје многе методе кристализације које раде на принципу дијализе, дифузија течности, мешања два раствора као и класичне методе испаравања, којима можемо добити кристале испитиваних протеина. Правило је да се корисна информација о структури може добити за кристале који дифрактују са резолуцијом већом од 4 ангстрема (400пм), што је граница за квалитет кристала који желимо да добијемо.
Ред 126:
Многи биомолекули од интереса нису још увек кристализовани на задовољавајући начин. Несавршености у структури кристала изазване нечистоћама, или постојањем бројних стабилних конформација протеина спречавају добијање слика атомске резолуције. Чак је предложено коришћење Интернационалне свемирске станице у процесу кристализације јер бестежинско стање редукује утицај варијација у температури на формирање кристала.
=== Снимање дифрактограма ===
Када је формиран, кристал се поставља тако да може да се нађе у снопу x зрака, и да је могуће ротирати га. Има више начина постављања узорка. Један старији је убацивање кристала у стаклену капилару напуњену раствором из којег је кристалисао, и постављање капиларе у дифрактометар. Модернији начин је постављање кристала на танку закривљену жицу и фиксирање мржњењем помоћу течног азота. Ниска температура истовремено редукује оштећења изазвану на узорку због велике енергије џ зрачења, а и минимализује термална кретања која на дифроктограму појачавају шум (Дебај-Велеров ефекат). Проблем је што може доћи до пуцања кристала у струји течног азота па је потребна додатна припрема узорка, која није увек изводљива.
Ред 134:
Пре него што је у експеримент уведено хлађење кристала подаци су добијани на собним температурама. Због горе описаних проблема који се јављају притом (шум) било је потребно извршити многострука мерења за један скуп података што је продужавало време анализе. Данас је време анализе додатно смањено и коришћењем скупа CCD детектора који покривају широк опсег углова истовремено.
=== Обрада података ===
Основни циљ РСА-е јесте одређивање функције расподеле електронске густине, ф(ρ) у кристалу. Подаци добијени експериментом представљају репрезентацију кристалне решетке у реципрочном простору. Математички је могуће из тога добити изглед решетке у реалном простору.
==== Фуријеова трансформација ====
Да бисмо то урадили, експериментално прикупљамо податке о Фуријеовој трансформацији ове функције, F(q), коју затим математичким путем обрађујемо да бисмо добили електронску густину у реалном простору. F(q) је структурни фактор који представља релативни интензитет расутог зрачења дуж правца вектора дифракције q, и изражава ефекат релативне позиције честице на расипање. Структурни фактор F(q) је у ствари Фуријеова трансформација структуре.
Ред 156:
што ћемо користити даље.
Генерално, функција F(q) је комплексна функција, тј. има поред амплитуде |F(q)|, и фазу
:<math>
Ред 162:
</math>
Интензитети дифрактованог зрачења добијени експериментално су у корелацији са амплитудом
Може се показати да увек важи:
Ред 172:
тј. у општем случају важи F(q) = F(-q), што је познато као Фриделов закон (Friedel), а рефлексије које одговарају q тј. –q називају се Фриделови парови. Као последица важења Фриделовог закона дифракциона слика добијена са било ког кристала увек је централно симетрична, што смањује број експерименталних података које треба прикупити при решавању кристалне структуре.
==== Проблем фазе ====
Постоји неколико начина да се одреде фазе, тј. реши фазни проблем. У најстарије методе за одређивање кристалне структуре спада метода пробе и грешке. Она се заснива на томе да се претпостави модел структуре, израчунају структурни фактори и упореде са експериментално добијеним. Ова метода може да се користи за једноставније структуре и има углавном историјски значај.
Данас постоји неколико погодних и широко коришћених начина да се релативно брзо и једноставно дође до задовољавајућег почетног модела. Неке методе се заснивају на израчунавању приближних вредности Φ(q)
==== Патерсонова (Patterson) функција ====
Врло позната последица Фуријеове трансформације је аутокорелациона теорема која каже да је аутокорелација c(r) функције
:<math>
Ред 192:
</math>
Стога аутокорелациона функција
=== Модел структуре ===
Када смо добили податак о почетној фази у стању смо да формирамо почетни модел. Координате атома и њихови Дебај-Велерови фактори се фитују према експерименталним подацима. Тиме добијамо нови сет фаза и нову мапу електронских густина. Затим експериментатор прегледа добијене податке, врши корекције на основу искуства или претпоставки и почиње нови круг побољшања на исти начин. То се наставља док се не постигне максимална корелација између експерименталних података и модела.
Ред 200:
Када је модел молекулске структуре завршен обично се уноси у неку кристалографску базу података, као што је Протеинска Банка Података, Protein Data Bank (за протеине), или Кембриџ базу података структура, Cambridge Structure Database (за мање молекуле). Многе структуре одређене у приватним, комерцијалним лабораторијама у медицинским истраживањима не налезе се у јавним кристалографским базама података.
=== Предности и мане ===
Ниједна друге техника откривена до сад не нуди толико података колико РСА, тј. тачније дифракција на монокристалу. Типичан кристал даје 20-30 хиљада рефлексија, где је свака представља један делић укупне информације о структури. Сви ови подаци компјутерском обрадом дају слику расподеле електронске густине са атомском резолуцијом. Захваљујући толиком броју независних података ово и јесте најбоља метода за одређивање атомске структуре било ког молекула.
Међутим, постоје и недостаци, углавном повезани са извођењем експеримента. Прво, потребан је кристал задовољавајућег квалитета, који као што смо видели није лако добити. Неки кристалографи су посветили и више од 10 година свог живота добијању монокристала протеина од интереса, нпр. протеина
== Литература ==
{{refbegin|2}}
* Љ. Карановић, Д. Полети, ‘Рендгенска структурна анализа’, Завод за уџбенике и наставна средства, Београд,2003
* -{Staff,’ Introduction to X-ray Diffraction’, Materials Research Laboratory, University of California, Santa Barbara.}-
* -{W.L. Bragg, "The Diffraction of Short Electromagnetic Waves by a Crystal", Proceedings of the Cambridge Philosophical Society, 17 (1912), 43–57.}-
* -{Ewald, P. P., editor ‘50 Years of X-Ray Diffraction’ (Reprinted in pdf format for the IUCr XVIII Congress, Glasgow, Scotland, Copyright © 1962, 1999 International Union of Crystallography).}-
* -{McPherson, A (1999). Crystallization of Biological Macromolecules. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-617-6.}-
* -{Drenth J. Principles of Protein X-Ray Crystallography. Springer-Verlag Inc. NY: 1999, ISBN 0-387-98587-5.}-
* -{Glusker JP, Lewis M, Rossi M. Crystal Structure Analysis for Chemists and Biologists. VCH Publishers. NY:1994, ISBN 0-471-18543-4.}-
* -{Rhodes G. Crystallography Made Crystal Clear. Academic Press. CA: 2000, ISBN 0-12-587072-8.}-
{{refend}}
== Спољашње везе ==
{{Commonscat|X-ray diffraction}}
* [http://acaschool.iit.edu/lectures04/JLiangXtal.pdf Кристализација малих молекула] {{en}}
{{-}}
| |||