Квантитативна анализа активности ензима

При квантитативном одређивању ензима у ткивним екстрактима, екстремно мале количине ензима које се налазе у ћелијама проузрокују проблеме. Али, каталитичка активност једног ензима обезбеђује осетљив и специфичан начин за његово мерење. Да би се измерила количина ензима у узорку ткивног екстракта или друге биолошке течности, мери се брзина реакције коју катализује тај ензим. Под погодним условима измерена брзина реакције је пропорционална количини присутног ензима. Гдје је то могуће, ова брзина се пореди са брзином катализованом познатом количином високо пречишћеног ензима. Међутим, није лако одредити број молекула или масу присутног ензима. Зато се резултати изражавају у интернационалним јединицама.Тако да се могу поредити релативне количине ензима у различитим екстрактима. Ензимске јединице се најчешће изражавају у микромолима (10^-6 мол), наномолима (10^-9 мол) или пикомолима (10^-12 мол) супстрата који изреагује или продуката који настаје за један минут.

Активност фермената представља количину супстрата која се промени у јединици времена под стандардним условима. Активност ензима може се одредити и мерењем брзине настајања продукта (или ређе, брзине нестајања супстрата). Од хемијских и физичких особина продуката или супстрата зависи која ће специфична метода бити изабрана за квантитативно одређивање. Често је погодно "купловати" продукт реакције са ензимом за који је овај продукт супстрат.

Одређивање активности ензима

Амилазе

Приближна слика о активности амилаза у неком материјалу може се добити на основу нијансе боје која настаје додавањем одмерене количине раствора јода садржају, који се састоји из једнаких количина скробног раствора и из постепено смањених количина биљног материјала у коме се активност фермената испитује.

Табела 1.1. Пример, припрема серије раствора од десет епрувета при одређивању активности амилаза

Број епрувете	Екстр.амилазе (мл)	Број епрувете	Екстр.амилазе (мл)
1	1.00	6	0.0125
2	0.500	7	0.00625
3	0.250	8	0.00312
4	0.125	9	0.00156
5	0.025	10	0.00078

Сахарификациона активност амилаза

Сахарификациона или амилолитичка активност амилазе може се мерити количином малтозе настале у току хидролизе скроба. Малтоза је редукујући шећер, и може се одредити применом једног од оксидоредукционих поступака. Активност амилазе може се одредити применом јодометријске методе на основу мерења пораста садржаја малтозе током инкубације.

Хидропероксидазе

Хидропероксидазе припадају класи ензима оксидоредуктаза, које су широко распрострањени у биљкама, зивотињама и микроорганизмима и каталису процесе оксидо-редукције. Ови процеси имају вазну функцију у процесу дисања и разним оксидоредукционим процесима , гдје се врши пренос водоника, односно електрона од супстрата донора (D), који се оксидује на акцептор (А) који се редукује.

Овој класи ензима припада подкласа хидропероксидаза, који каталишу разлагање водоник-пероксида (Х₂О₂) који настаје као продукат метаболизма ћелије и деле се, према природи реакције коју каталишу, на пероксидазе и каталазе.

Каталазе

Структура каталазе

Каталаза је ензим који врло интезивно каталише разлагање Х₂О₂ на кисеоник и воду. Ово је бимолекулска реакција у којој се један молекул Х₂О₂ јавља као донатор електрона, тј.оксидише се до кисеоника, а други као акцептор електрона, тј.редукује се до воде. Каталаза је у хемијском погледу протеид, у коме непротеинску компоненту представља Фе-порфирински комплекс (хематин). То је ензим велике каталитичке моћи гдје кисела средина инактивира каталитичку активност каталазе. Квантитативно одређивање активности каталазе засновано је на реакцији водоник-пероксида који остаје неразложен после дејства каталазе, са калијум перманганатом уз образовање слободног кисеоника.

Пероксидазе

Пероксидазе каталишу реакције у којима се вода јавља као акцептор електрона, при чему се супстрат оксидише до, а водоник-пероксид редукује до воде. Ови ензими су углавном заступљени у [[Биљна ћелија|биљним ћелијама). Пероксидазе су протеиди који у својој структури садрже фери-протопорфирин (протопорфирин са гвозђем у центру). Активност пероксидазе изражава се бројем микромола аскорбинске киселине оксидоване за минут по 1г узорка:

Ак = (60сец./време у сец.) x 10

Аскорбиноксидазе

Аскорбиноксидаза припада подкласи ензима оксидаза (велика класа ензима-оксидоредуктаза) којој припада подкласа фенолоксидаза. Фенолоксидазе су бакар-протеиди и широко су заступљени у биљном, зивотињском свету и микроорганизмима. Фенолоксидазе вршсе катализу оксидације моно-, ди- и полифенола и њихових деривата. Њихова хемијска функција се своди на транспорт електрона који је повезан са оксидацијом неког супстрата и редукцијом кисеоника или водоник-пероксида. Аскорбиноксидазе нарочито има у зеленим деловима биљака (купус, салата) у неким плодовима (шипурак, дрен) и у кртолама (кромпир); она каталише оксидацију аскорбинске киселине у хидрат дехидроаксорбинске киселине, уз учешће кисеоника и воде. Након дејства ензима, пошто се утроши сва његова количина, остаје извесна количина супстрата (аскорбинске киселине) у вишку који се одређује јодиметријски.

Трипсини

Велика класа ензима хидролазе каталишу хидролитичко разлагање разних сложених органских једињења на знатно простије у присуству воде. Вода овдје има улогу акцептора на који се врши пренос других група, остатака или радикала са молекула супстрата који подлеже хидролизи. хидролазама припадају сви пробавни ензими, који делују интра- или екстрацелуларно и који процес варања обезбеђује преко низа уређених хидролитичких реакција кроз које се сложени молекули органских једињења (протеини, липиди, угљени хидрати и др.) релативно лако и постепено преводе у ниже, једноставније облике (који даље подлежу променама оксидације, синтезе...). Овој класи припада велики број ензима који су сврстани по механизму хидролизе у подгрупе: естеразе, карбохидразе и пептидазе. Пептидазе катализују хидролитичко разлагање пептидне везе (-ЦО-НХ-), која је заступљена у протеинима, полипептидима, као и у производима њиховог разлагања. Овај процес назива се протеолиза, а ензими-протеолитички ензими. У зависности од места деловања протеолитички ензими се могу поделити на: егзопептидазе и ендопептидазе. Трипсин припада групи серинских ендопептидаза. То су ензими који у активном центру имају серин и хистедин, а каталишу разлагање пептидних веза у унутрашњости макромолекула и не делују на пептидне везе које се налазе на крајевима пептидног ланца. Трипсин је ензим панкреасног сока, ћелије панкреаса га луче у облику проензиима трипсиногена (протрипсин) који (на пХ 75-8,5 под утицајем ензима ентерокиназе, а касније аутолизом) прелази у активну форму-трипсин. Његова оптимална пХ активности је 8,0.^[1]^[2]

Види још

Референце

^ др Мирољуб Бараћ, др Слађана Станојевић и сарадници, Практикум из биохемије. . Beograd. 2010. ISBN 978-86-7834-098-7.
^ Славица Спасић, Зорана Јелић, Весна Калимановска, Општа биохемија

Спољашње везе

Анализа крви

[1] др Мирољуб Бараћ, др Слађана Станојевић и сарадници, Практикум из биохемије. . Beograd. 2010. ISBN 978-86-7834-098-7.

[2] Славица Спасић, Зорана Јелић, Весна Калимановска, Општа биохемија

[1]

[2]