Википедија

Лигација (молекуларна биологија)

Овај чланак је о лигацији нуклеинских киселина. За лигацију пептида, погледајте хемијска лигација. За отхер усес, погледајте Лигација.

У молекуларној биологији, лигација је спајање два фрагмента нуклеинских киселина помоћу ензима. То је есенцијална лабораторијска процедура при молекуларном клонирању ДНК, где се ДНК фрагменти спајају да би се формирали рекомбинантни ДНК молекули, нпр. кад се страни ДНК фрагмент умеће у плазмид. Крајеви ДНК фрагмената се спајају уз формирање фосфодиестарских веза између 3'-хидроксила једног ДНК терминуса и 5'-фосфорила другог. РНК се исто тако може лигирати. Кофактор обично учествује у овим реакцијама, и то је најчешће АТП или НАД+.

Лигација се у лабораторији нормално изводи користећи Т4 ДНК лигазе, мада је процедура за лигацију без употребе стандардне ДНК лигазе исто тако популарна.

Фактори који утичу на лигацију

уреди

Фактори који генерално утичу на ензимски посредоване хемијске реакције прородно утичу и на реакцију лигације, нпр. концентрација ензима и реактаната, као и реакциона температура и дужина периода инкубације. Лигација је компликована чињеницом да жељени лигациони продукти већине лигационих реакција требају да буду комбинације два различита ДНК молекула, да реакција обухвата интер- и интра-молекуларне реакције, и да је неопходан додатни корак спајања ради одвијање ефективне лигације.

ДНК концентрација

уреди

Концентрација ДНК може да утиче на брзину лигације, и на то да ли је лигација интермолекуларна или интрамолекуларна реакција. Лигација се састоји од спајања једног краја ДНК са другим, ме]утим, сваки ДНК фрагмент има два краја, и ако су крајеви компатибилни, ДНК молекул се може циклизовати спајањем крајева једног фрагмента. При високим ДНК концентрацијама, повећана је вероватноћа одвијања интермолекуларне лигације, док је на нижим ДНК концентрацијама интрамолекуларна реакција вероватнија. Ефикасност трансформације линеарне ДНК је знатно нижа неко циркуларне ДНК, и да би дошло до ДНК циркуларизације, ДНК концентрација не треба да буде сувише високах. Опште правило је да тотална ДНК концентрација треба да буде мањаод 10 μг/мл.[1]

Релативна концентрација ДНК фрагмената, као и њихова дужина, су исто тако фактори који могу да утичу на то да ли долази до интермолекуларне или интрамолекуларне реакције.

Концентрација ДНК може да буде вештачки повећана додавањем кондензирајућих агенаса као што су кобалт хексамин и биогени полиамини попут спермидина, или користећи агенсе претрпавања као што је полиетилен гликол (ПЕГ), који исто тако повећава ефективну концентрацију ензима.[2][3] Треба имати у виду да адитиви као што је кобалт хексамин могу да ексклузивно произведу интермолекуларне реакције,[4] чиме се формирају линеарни конкатимери, уместо кружне ДНК која је подеснија за трансформацију у пласмидну ДНК. Конкатимери су непожељни за плазмидну лигацију. Ако је неопходно да се користе адитиви и лигацији плазмида, преферентно се користи ПЕГ пошто тај агенс промовише интрамолелуларну као и интермолекуларну лигацију.[5]

Концентрација лигазе

уреди

Што је виша концентрација лигазе, то је већа брзина лигације. Лигација тупих крајева је знато мање ефикасна од лигације лепљивих крајева, те се користи висока концентрација лигазе при лигацији тупих крајева. Висока ДНК концентрација лигазе се може користити у комбинацији са ПЕГ ради убрзавања реакције, и стога је ПЕГ често компонента гарнитура за брзу лигацију.[6][7]

Температура

уреди

Разматрање температуре реакције лигације обухвата два аспекта. Први је оптимална температуре за дејство ДНК лигазе, која је 37°C, а други је температура топљења (Тм) ДНК крајева који се спајају. Температура топљења зависи од дужине и базне композиције ДНК препуста — што је већи број Г и C база, то је виша Тм, пошто Г-C басе формирају три водоничне везе за разлику од две за А-Т базне парове — уз исти допринос слагању базних парова између фрагмената. Да би се реакција лигације ефикасно одвијала, крајеви требају да буду стабилно загрејани. У лигационим експериментима, Тм ДНК крајева је генерално знатно нижа од 37°C. Оптимална температура за лигацију кохезивних крајева је стога компромис између најподесније температуре за активност ДНК лигазе и Тм на којој крајеви могу да се асоцирају.[8] Међутим, различити рестрикциони ензими формирају различите крајеве, и композиција крајева које производе може да буде различита. Температура топљења и оптимална температура могу да варирају у широком опсегу у зависности од кориштених рестрикционих ензима.[9][10] Лигације такође често обухватају спајање крајева који су формирани различитим рестрикционим ензимима у истој реакционој смеши, из ког разлога није увек практично да се изабере оптимална температура за специфичну реакцију лигације. Већина протокола једноставно користи 12-16°C, собну температуру, или 4°C.

Састав пуфера

уреди

Јонска јачина кориштеног пуфера може да утиче на лигацију. Врсте присутних катјона исто тако могу да утичу на лигациону реакцију, на пример, превелика количина На+ може да доведе до тога да ДНК постане крућа чиме се повећава вероватноћа интермолекуларне лигације. При високој концентрацији моновалентног катјона (>200 мМ) лигација може да буде скоро потпуно инхибирана.[11] Стандардни пуфер који се користи за лигацију је дезајниран да минимизује јонске ефекте.[12]

Види још

уреди

Референце

уреди
  1. ^ Јосепх Самброок; Давид Русселл. „Цхаптер 1: Пласмидс анд Тхеир Усефулнесс ин Молецулар Цлонинг”. Молецулар Цлонинг - А Лабораторy Мануал. 1 (3рд изд.). стр. 1.20—1.21. ИСБН 978-0-87969-577-4. 
  2. ^ Ј Р Русцхе; П Хоwард-Фландерс (1985-03-25). „Хеxамине цобалт цхлориде промотес интермолецулар лигатион оф блунт енд ДНА фрагментс бy Т4 ДНА лигасе”. Нуцлеиц Ацидс Ресеарцх. 13 (6): 1997—2008. ПМЦ 341130  . ПМИД 4000951. дои:10.1093/нар/13.6.1997. 
  3. ^ Зиммерман СБ, Пхеиффер БХ (1983). „Мацромолецулар цроwдинг аллоwс блунт-енд лигатион бy ДНА лигасес фром рат ливер ор Есцхерицхиа цоли”. Процеедингс оф тхе Натионал Ацадемy оф Сциенцес оф тхе Унитед Статес оф Америца. 80 (19): 5852—6. ПМЦ 390173  . ПМИД 6351067. дои:10.1073/пнас.80.19.5852. 
  4. ^ Јамес Р. Русцхе; Паул Хоwард-Фландерс (1985-03-25). „Хеxамине цобалт цхлориде промотес интермолецулар лигатион оф блунт енд ДНА фрагментс бy Т4 ДНА лигасе”. Нуцлеиц Ацидс Ресеарцх. 13 (6): 1997—2008. ПМЦ 341130  . ПМИД 4000951. дои:10.1093/нар/13.6.1997. 
  5. ^ К Хаyасхи; M Наказаwа; Y Исхизаки; Н Хираока; А Обаyасхи (1986-10-10). „Регулатион оф интер- анд интрамолецулар лигатион wитх Т4 ДНА лигасе ин тхе пресенце оф полyетхyлене глyцол”. Нуцлеиц Ацидс Ресеарцх. 14 (19): 7617—7631. ПМЦ 311784  . ПМИД 3022231. дои:10.1093/нар/14.19.7617. 
  6. ^ „ФАQ”. НЕБ. 
  7. ^ „Qуицк Лигатион Кит”. НЕБ. 
  8. ^ Роберт W. Олд; Сандy Б. Примросе. Принципле оф Гене Манипулатион - Ан Интродуцтион то Генетиц Енгинееринг (5тх изд.). Блацкwелл Сциентифиц. стр. 36. ИСБН 9780632037124. 
  9. ^ L Ферретти; V Сгарамелла (1981-01-10). „Температуре депенденце оф тхе јоининг бy Т4 ДНА лигасе оф термини продуцед бy тyпе II рестрицтион ендонуцлеасес”. Нуцлеиц Ацидс Ресеарцх. 9 (1): 85—93. ПМЦ 326670  . ПМИД 6259621. дои:10.1093/нар/9.1.85. 
  10. ^ Дугаицзyк А, Боyер ХW, Гоодман ХМ (1975-07-25). „Лигатион оф ЕцоРИ ендонуцлеасе-генератед ДНА фрагментс инто линеар анд цирцулар струцтурес”. Јоурнал оф Молецулар Биологy. 96 (1): 171—84. ПМИД 169355. дои:10.1016/0022-2836(75)90189-8. 
  11. ^ Раае АЈ, Клеппе РК, Клеппе К (1975-10-15). „Кинетицс анд еффецт оф салтс анд полyаминес он Т4 полyнуцлеотиде лигасе”. Еуропеан Јоурнал оф Биоцхемистрy. 60 (2): 437—43. ПМИД 173544. дои:10.1111/ј.1432-1033.1975.тб21021.x. 
  12. ^ Г. Луцотте; Ф. Банеyx (1993). Интродуцтион то Молецулар Цлонинг Тецхниqуес. Wилеy-Блацкwелл. стр. 156. ИСБН 978-0471188490. 
Преузето из „https://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=Ligacija_(molekularna_biologija)&oldid=26758921”