Википедија

Saudern blot

Saudern blot (eng. Southern blot) je metoda koja se koristi u molekularnoj biologiji za otkrivanje specifične sekvence DNK u uzorcima DNK. Saudern blot kombinuje prenos fragmenata DNK koji su razdvojeni gel-elektroforezom na filter membranu i naknadno detektovanje fragmenata hibridizacijom sa obeleženim probama.

Agarozni gel
Posuda sa sabijenim papirnim salvetama, membranom od nitroceluloze ili najlona, gelom, rastvorom soli i staklenom pločom.
Saudern blot membrana nakon hibridizacije i ispiranja.
Agarozni gel pod ultraljubičastim osvetljenjem nakon primene metode Saudern blot.
Saudern blot autoradiogram.

Metoda je dobila ime po britanskom biologu Edvinu Saudernu (eng. Edwin Southern) koji ju je prvi put objavio 1975. [1] Ostale metode blotiranja (Vestern blot [2](Western blot), Nordern blot (Northern blot), Istern blot (Eastern blot) ili Sautvestern blot (Southwestern blot)) koriste slične principe, ali koristeći RNK ili protein umesto DNK i imenovane su po analogiji sa Saudern blotom. [3]

Metod uredi

  1. Enzimi restrikcione endonukleze koriste se za sečenje molekula DNK velike molekulske mase na manje fragmente.
  2. Elektroforeza dvolančanih DNK fragmenata na agaroznom gelu kako bi se fragmenti razdvojili po veličini.
  3. Ako su neki fragmenti DNK veći od 15 kb, tada pre analize agarozni gel može biti tretiran kiselinom, kao što je razblažena HCl. Ovo dovodi do delimične hidrolize, tj. fragmentacije molekula DNK uzrokovanu depurinacijom i na taj način omogućava efikasniji prenos više manjih fragmenata molekula DNK sa gela na membranu.
  4. Agarozni gel se stavlja u alkalni rastvor (koji obično sadrži natrijum hidroksid) da bi se denaturisala dvolančana DNK, tj. dobilo dva jednolančana DNK fragmenta iz jednog dvolančanog. Denaturacija se postiže tako što alkalni rastvor poboljšava vezivanje negativno naelektrisanih ostataka timina DNK za pozitivno naelektrisane amino grupe filter membrane. Alkalni rastvor takođe uništava svaku zaostalu RNK koja može biti prisutna u uzorku sa DNK. Ovo je takozvana metoda alkalnog prenosa. Denaturisana DNK je potrebna za kasniju hibridizaciju sa probom (korak 7.).
  5. Uz gel se postavlja sloj nitrocelulozne (ili alternativno najlonske) membrane . Pritisak se nanosi ravnomerno na gel (bilo usisavanjem, bilo postavljanjem snopa papirnih salveta i tega na membranu i gel), kako bi se osigurao dobar i ravnomerni kontakt gela i membrane. Ako se transfer DNK sa gela na membranu vrši usisavanjem, koristi se 20X SSC pufer da se osigura zaptivanje i spreči sušenje gela. Prelazak pufera kapilarnim delovanjem iz regiona visokog vodnog potencijala (agarozni gel) u područje niskog vodnog potencijala (obično filter papir) se zatim koristi za premeštanje DNK iz gela na membranu. Jonske veze vezuju prenesenu DNK za membranu usled negativnog naelektrisanja DNK i pozitivnog naelektrisanja membrane.
  6. Membrana se zatim zagreva u vakuumu ili običnoj peći na 80 °C tokom 2 sata (standardni uslovi; nitrocelulozna ili najlonska membrana) ili izloženi ultraljubičastom zračenju (najlonska membrana) za trajno vezivanje prenesene DNK na membranu.
  7. Membrana se zatim izlaže probi za hibridizaciju- jedinstven fragment DNK sa specifičnom sekvencom komplementarnom ciljnoj sekvenci (sekvenca čija se prisutnost u uzorku DNK treba potvrditi). DNK proba je obeležena tako da se može detektovati, obično uključivanjem radioaktivnosti ili obeležavanjem molekula fluorescentnim ili hromogenim bojama. U nekim slučajevima proba za hibridizaciju može da se napravi od RNK, a ne iz DNK. Da bi se osigurala specifičnost vezivanja probe za DNK uzorka, najčešće metode hibridizacije koriste DNK sperme lososa ili haringe za blokiranje površine membrane i ciljne DNK, dejonizovani formamid i deterdžente kao što je SDS da bi se smanjilo nespecifično vezivanje proba.
  8. Posle hibridizacije, višak probe se ispere sa membrane (obično se koristi SSC pufer ). Obrazac hibridizacije se na radiografskom filmu vizuelno prikazuje autoradiografijom u slučaju radioaktivne ili fluorescentne probe ili razvijanjem boje na membrani ako se koristi hromogena metoda detekcije.

Rezultat uredi

Hibridizacija probe za određeni fragment DNK na filter membrani ukazuje da ovaj fragment sadrži DNK sekvencu koja je komplementarna probi. Korak prenosa DNK sa gela za elektroforezu na membranu omogućava lako vezivanje obeležene hibridizacione probe za fragmente DNK uzorka koji ispitujemo. Takođe omogućava fiksiranje hibrida ciljna DNK-proba, koja je potrebna za analizu autoradiografijom ili drugim metodama detekcije.

Saudern blot izvršen restrikcionom digestijom genomske DNK može se koristiti za određivanje broja sekvenci (npr.broja kopija gena) u genomu. Proba koja je hibridizovala sa samo jednim DNK segmentom će proizvesti jednu traku na Saudern blotu, dok će se više traka opažati kada proba hibridizuje sa nekoliko vrlo sličnih sekvenci (npr.onih koje mogu biti rezultat dupliranja sekvenci).

Modifikacija uslova hibridizacije (na primer, povećanje temperature hibridizacije ili smanjenje koncentracije soli) može se koristiti za povećanje specifičnosti vezivanja probe za DNK uzorka.

Primene uredi

Saudern blot se može koristiti za određivanje nepoznate sekvence gena čiji je proteinski produkt poznat. Na osnovu proteinskog produkta poštujući pravila genetičkog koda dizajniraju se se probe tako da su komplementarne pretpostavljenoj sekvenci datog gena. Probe su hemijski sintetisane, radioaktivno obeležene i koriste se za pretraživanje DNK biblioteke ili druge kolekcije kloniranih fragmenata DNK. Sekvence DNK koje hibridizuju sa probom se koriste da bi se odredila sekvenca ciljnog gena.

Saudern blot se takođe može koristiti za identifikaciju metilovanih mesta u određenim genima. Posebno su korisne restrikcione nukleaze MspI i HpaII jer obe prepoznaju i seku DNK na istom mestu. Međutim, HpaII zahteva da citozin unutar tog mesta bude metilovan, dok MspI seče samo nemetilovanu DNK na istom tom mestu. Stoga će svako metilovano mesto unutar sekvence analizirane određenom probom seći HpaII, a ne MspI. Na osnovu obrasca sečenja DNK koji se vizualizuje zahvaljujući Saudern blot metodi zaključuje se da li je određeni deo sekvence uzorka DNK metilovan ili nije. [4]

Vidi još uredi

Reference uredi

  1. ^ Southern, Edwin Mellor (5. 11. 1975). „Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”. Journal of Molecular Biology. 98 (3): 503—517. ISSN 0022-2836. PMID 1195397. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0. 
  2. ^ Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). „Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications”. PNAS. 76 (9): 4350—4. PMC 411572  . PMID 388439. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. 
  3. ^ Burnette, W. Neal (april 1981). „Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibody and Radioiodinated Protein A”. Analytical Biochemistry. 112 (2): 195—203. ISSN 0003-2697. PMID 6266278. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5. 
  4. ^ Biochemistry 3rd Edition, Matthews, Van Holde et al, Addison Wesley Publishing, pg 977

Spoljašnje veze uredi

Preuzeto iz „https://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=Саудерн_блот&oldid=26999745”